उत्पादों
2019-nCoV के लिए लाइफ़कोसम SARS-Cov-2-RT-PCR डिटेक्शन किट
अपेक्षित उपयोग
इस किट का उपयोग गले के स्वाब, नासॉफिरिन्जियल स्वाब, ब्रोन्कोएलेवोलर लैवेज द्रव, थूक का उपयोग करके नए कोरोनावायरस (2019-nCoV) के गुणात्मक पता लगाने के लिए किया जाता है। इस उत्पाद का पता लगाने का परिणाम केवल नैदानिक संदर्भ के लिए है, और इसका उपयोग नैदानिक निदान और उपचार के लिए एकमात्र सबूत के रूप में नहीं किया जाना चाहिए। रोगी की नैदानिक अभिव्यक्तियों और अन्य प्रयोगशाला परीक्षणों के संयोजन में स्थिति का व्यापक विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।
निरीक्षण सिद्धांत
किट वन-स्टेप आरटी-पीसीआर तकनीक पर आधारित है। वास्तव में, 2019 नए कोरोनावायरस (2019-nCoV) ORF1ab और N जीन को प्रवर्धन लक्ष्य क्षेत्रों के रूप में चुना गया था। विशिष्ट प्राइमर और फ्लोरोसेंट जांच (एन जीन जांच को FAM के साथ लेबल किया जाता है और ORF1ab जांच को HEX के साथ लेबल किया जाता है) नमूनों में 2019 नए प्रकार के कोरोनावायरस RNA का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। किट में नमूना संग्रह, RNA और PCR प्रवर्धन की प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए एक अंतर्जात आंतरिक नियंत्रण पहचान प्रणाली (CY5 के साथ लेबल की गई आंतरिक नियंत्रण जीन जांच) भी शामिल है, जिससे झूठे नकारात्मक परिणामों को कम किया जा सके।
मुख्य घटक
| अवयव | आयतन（48टी/किट） |
| आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान | 96µl |
| एनसीओवी प्राइमर टाकमैन प्रोबेमिक्सचर (ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene) | 864µl |
| नकारात्मक नियंत्रण | 1500µl |
| nCOV सकारात्मक नियंत्रण (एल ORF1ab एन जीन) | 1500µl |
स्वयं अभिकर्मक: आरएनए निष्कर्षण या शुद्धिकरण अभिकर्मक। नकारात्मक/सकारात्मक नियंत्रण: सकारात्मक नियंत्रण लक्ष्य खंड युक्त आरएनए है, जबकि नकारात्मक नियंत्रण न्यूक्लिक एसिड मुक्त पानी है। उपयोग के दौरान, उन्हें निष्कर्षण में भाग लेना चाहिए और संक्रामक माना जाना चाहिए। उन्हें प्रासंगिक नियमों के अनुसार संभाला और निपटाया जाना चाहिए।
आंतरिक संदर्भ जीन मानव RnaseP जीन है।
भंडारण की स्थिति और समाप्ति तिथि
-20±5℃, 5 बार से अधिक बार जमने और पिघलने से बचें, 6 महीने के लिए वैध।
लागू साधन
FAM / HEX / CY5 और अन्य मल्टी-चैनल फ्लोरोसेंट पीसीआर उपकरण के साथ।
नमूना आवश्यकताएँ
1. लागू नमूना प्रकार: गले के स्वाब, नासोफेरींजल स्वाब, ब्रोन्कोएल्वियोलर लैवेज द्रव, थूक।
2. नमूना संग्रह (एसेप्टिक तकनीक)
ग्रसनी स्वैब: टॉन्सिल और पश्च ग्रसनी दीवार को एक ही समय में दो स्वैब से पोंछें, फिर स्वैब के सिर को सैंपलिंग घोल वाली टेस्ट ट्यूब में डुबोएं
थूक: रोगी को गहरी खांसी होने के बाद, खांसी वाले थूक को सैंपलिंग सॉल्यूशन युक्त स्क्रू कैप टेस्ट ट्यूब में इकट्ठा करें; ब्रोंकोएल्वियोलर लैवेज द्रव: मेडिकल पेशेवरों द्वारा नमूना लेना। 3. नमूनों का भंडारण और परिवहन
वायरस अलगाव और आरएनए परीक्षण के लिए नमूनों का परीक्षण जल्द से जल्द किया जाना चाहिए। जिन नमूनों का 24 घंटे के भीतर पता लगाया जा सकता है उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; जो नमूने 24 घंटे के भीतर पता नहीं लगाए जा सकते हैं उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
घंटों को -70 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे संग्रहित किया जाना चाहिए (यदि -70 डिग्री सेल्सियस की कोई भंडारण स्थिति नहीं है, तो उन्हें रखा जाना चाहिए)
अस्थायी रूप से -20 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संग्रहित)। परिवहन के दौरान नमूनों को बार-बार जमने और पिघलने से बचना चाहिए। नमूनों को संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रयोगशाला में भेज दिया जाना चाहिए। यदि नमूनों को लंबी दूरी तक ले जाने की आवश्यकता है, तो सूखी बर्फ भंडारण की सिफारिश की जाती है।
परीक्षण विधियाँ
1 नमूना प्रसंस्करण और आरएनए निष्कर्षण (नमूना प्रसंस्करण क्षेत्र)
आरएनए निष्कर्षण के लिए 200μl तरल नमूना लेने की सिफारिश की जाती है। संबंधित निष्कर्षण चरणों के लिए, वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट के निर्देशों का संदर्भ लें। नकारात्मक और नकारात्मक दोनों
इस किट में नियंत्रण निष्कर्षण में शामिल थे।
2 पीसीआर अभिकर्मक तैयारी (अभिकर्मक तैयारी क्षेत्र)
2.1 किट से सभी घटकों को निकालें और कमरे के तापमान पर पिघलाकर मिलाएँ। उपयोग से पहले कुछ सेकंड के लिए 8,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें; अभिकर्मकों की आवश्यक मात्रा की गणना करें, और प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करें जैसा कि निम्नलिखित तालिका में दिखाया गया है:
| अवयव | एन सर्विंग (25µl सिस्टम) |
| एनसीओवी प्राइमर टाकमैन प्रोबमिक्सचर | 18 µl × एन |
| आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान | 2 µl × एन |
| *N = परीक्षण किए गए नमूनों की संख्या + 1 (नकारात्मक नियंत्रण) + 1 (nCOVसकारात्मक नियंत्रण) | |
2.2 घटकों को अच्छी तरह से मिश्रित करने के बाद, ट्यूब की दीवार पर मौजूद सभी तरल को ट्यूब के नीचे गिरने देने के लिए थोड़े समय के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर 20 µl प्रवर्धन प्रणाली को पीसीआर ट्यूब में डालें।
3 नमूनाकरण (नमूना तैयारी क्षेत्र)
निष्कर्षण के बाद नेगेटिव और पॉजिटिव कंट्रोल के 5μl डालें। परीक्षण किए जाने वाले नमूने के RNA को PCR प्रतिक्रिया ट्यूब में डाला जाता है।
ट्यूब को कसकर बंद करें और प्रवर्धन पहचान क्षेत्र में स्थानांतरित करने से पहले कुछ सेकंड के लिए 8,000 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र करें।
4 पीसीआर प्रवर्धन (प्रवर्धित पहचान क्षेत्र)
4.1 प्रतिक्रिया ट्यूब को उपकरण के नमूना सेल में रखें, और पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें:
| अवस्था | चक्र संख्या | तापमान(डिग्री सेल्सियस) | समय | संग्रहसाइट |
| रिवर्सTRANSCRIPTION | 1 | 42 | 10मिनट | - |
| पूर्व विकृतीकरणn | 1 | 95 | 1मिनट | - |
| चक्र | 45 | 95 | 15 सेकंड | - |
| 60 | 30 से | डेटा संग्रहण |
उपकरण पहचान चैनल चयन: फ्लोरोसेंट सिग्नल के लिए FAM、HEX、CY5 चैनल चुनें। संदर्भ फ्लोरोसेंट NONE के लिए, कृपया ROX न चुनें।
5 परिणाम विश्लेषण (कृपया सेटिंग के लिए प्रत्येक उपकरण के प्रयोगात्मक निर्देशों का संदर्भ लें)
प्रतिक्रिया के बाद, परिणाम सहेजें। विश्लेषण के बाद, छवि के अनुसार आधार रेखा के प्रारंभिक मूल्य, समाप्ति मूल्य और सीमा मूल्य को समायोजित करें (उपयोगकर्ता वास्तविक स्थिति के अनुसार समायोजित कर सकता है, प्रारंभिक मूल्य 3 ~ 15 पर सेट किया जा सकता है, समाप्ति मूल्य 5 ~ 20 पर सेट किया जा सकता है, समायोजन) लॉगरिदमिक ग्राफ में खिड़की की दहलीज पर, दहलीज रेखा लॉगरिदमिक चरण में है, और नकारात्मक नियंत्रण का प्रवर्धन वक्र एक सीधी रेखा या दहलीज रेखा से नीचे है)।
6 गुणवत्ता नियंत्रण (परीक्षण में एक प्रक्रियात्मक नियंत्रण शामिल है) नकारात्मक नियंत्रण: FAM, HEX, CY5 पहचान चैनलों के लिए कोई स्पष्ट प्रवर्धन वक्र नहीं
COV पॉजिटिव नियंत्रण: FAM और HEX डिटेक्शन चैनलों का स्पष्ट प्रवर्धन वक्र, Ct मान≤32, लेकिन CY5 चैनल का कोई प्रवर्धन वक्र नहीं;
उपरोक्त आवश्यकताओं को एक ही प्रयोग में एक साथ पूरा किया जाना चाहिए; अन्यथा, प्रयोग अमान्य होगा और उसे दोहराया जाना होगा।
7 परिणामों का निर्धारण.
7.1 यदि परीक्षण नमूने के FAM और HEX चैनलों में कोई प्रवर्धन वक्र या Ct मान> 40 नहीं है, और CY5 चैनल में एक प्रवर्धन वक्र है, तो यह अनुमान लगाया जा सकता है कि नमूने में कोई 2019 नया कोरोनावायरस (2019-nCoV) RNA नहीं है;
.2 यदि परीक्षण नमूने में FAM और HEX चैनलों में स्पष्ट प्रवर्धन वक्र हैं, और Ct मान ≤40 है, तो यह अनुमान लगाया जा सकता है कि नमूना 2019 नए कोरोनावायरस (2019-nCoV) के लिए सकारात्मक है।
7.3 यदि परीक्षण नमूने में FAM या HEX के केवल एक चैनल में स्पष्ट प्रवर्धन वक्र है, और Ct मान ≤40 है, और दूसरे चैनल में कोई प्रवर्धन वक्र नहीं है, तो परिणामों का पुनः परीक्षण किया जाना चाहिए। यदि पुनः परीक्षण के परिणाम सुसंगत हैं, तो नमूने को नए परीक्षण के लिए सकारात्मक माना जा सकता है।
कोरोनावायरस 2019 (2019-nCoV)। यदि पुन: परीक्षण परिणाम नकारात्मक है, तो यह अनुमान लगाया जा सकता है कि नमूना 2019 नए कोरोनावायरस (2019-nCoV) के लिए नकारात्मक है।
सकारात्मक निर्णय मूल्य
किट के संदर्भ सीटी मान को निर्धारित करने के लिए आरओसी वक्र विधि का उपयोग किया जाता है तथा आंतरिक नियंत्रण संदर्भ मान 40 है।
परीक्षण परिणामों की व्याख्या
1.प्रत्येक प्रयोग को नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रणों के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। परीक्षण के परिणाम केवल तभी निर्धारित किए जा सकते हैं जब नियंत्रण गुणवत्ता नियंत्रण आवश्यकताओं को पूरा करते हैं
2. जब FAM और HEX डिटेक्शन चैनल सकारात्मक होते हैं, तो सिस्टम प्रतिस्पर्धा के कारण CY5 चैनल (आंतरिक नियंत्रण चैनल) से परिणाम नकारात्मक हो सकता है।
3.जब आंतरिक नियंत्रण परिणाम नकारात्मक होता है, यदि टेस्ट ट्यूब के FAM और HEX डिटेक्शन चैनल भी नकारात्मक होते हैं, तो इसका मतलब है कि सिस्टम अक्षम है या ऑपरेशन गलत है, परीक्षण अमान्य है। इसलिए, नमूनों को फिर से जांचने की आवश्यकता है।
