उत्पादों
2019-nCoV के लिए लाइफकोसम SARS-Cov-2-RT-पीसीआर डिटेक्शन किट
अपेक्षित उपयोग
इस किट का उपयोग गले के स्वैब, नासॉफिरिन्जियल स्वैब, ब्रोन्कोएल्वियोलर लैवेज तरल पदार्थ, थूक का उपयोग करके नए कोरोनोवायरस (2019-nCoV) का गुणात्मक पता लगाने के लिए किया जाता है। इस उत्पाद का पता लगाने का परिणाम केवल नैदानिक संदर्भ के लिए है, और इसे केवल के रूप में उपयोग नहीं किया जाना चाहिए नैदानिक निदान और उपचार के लिए साक्ष्य। रोगी की नैदानिक अभिव्यक्तियों और अन्य प्रयोगशाला परीक्षणों के साथ संयोजन में स्थिति का एक व्यापक विश्लेषण की सिफारिश की जाती है।
निरीक्षण सिद्धांत
यह किट वन-स्टेप आरटी-पीसीआर तकनीक पर आधारित है।वास्तव में, 2019 नए कोरोनोवायरस (2019-nCoV) ORF1ab और N जीन को प्रवर्धन लक्ष्य क्षेत्रों के रूप में चुना गया था।विशिष्ट प्राइमर और फ्लोरोसेंट जांच (एन जीन जांच को एफएएम के साथ लेबल किया जाता है और ओआरएफ1एबी जांच को एचईएक्स के साथ लेबल किया जाता है) को नमूनों में 2019 नए प्रकार के कोरोनोवायरस आरएनए का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।किट में नमूना संग्रह, आरएनए और पीसीआर प्रवर्धन की प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए एक अंतर्जात आंतरिक नियंत्रण पहचान प्रणाली (सीवाई 5 के साथ लेबल किया गया आंतरिक नियंत्रण जीन जांच) भी शामिल है, जिससे गलत नकारात्मक परिणामों को कम किया जा सके।
प्रमुख तत्व
| अवयव | आयतन（48टी/किट） |
| आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान | 96µl |
| एनसीओवी प्राइमर टाकमैन प्रोबेमिक्सचर (ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene) | 864µl |
| नकारात्मक नियंत्रण | 1500µl |
| nCOV सकारात्मक नियंत्रण (l ORF1ab N जीन) | 1500µl |
स्वयं के अभिकर्मक: आरएनए निष्कर्षण या शुद्धिकरण अभिकर्मक।नकारात्मक/सकारात्मक नियंत्रण: सकारात्मक नियंत्रण आरएनए है जिसमें लक्ष्य टुकड़ा होता है, जबकि नकारात्मक नियंत्रण न्यूक्लिक एसिड मुक्त पानी होता है।उपयोग के दौरान, उन्हें निष्कर्षण में भाग लेना चाहिए और संक्रामक माना जाना चाहिए।उन्हें प्रासंगिक नियमों के अनुसार संभाला और निपटाया जाना चाहिए।
आंतरिक संदर्भ जीन मानव RnaseP जीन है।
भंडारण की स्थिति और समाप्ति तिथि
-20±5℃, बार-बार जमने और 5 बार से अधिक पिघलने से बचें, 6 महीने के लिए वैध।
लागू साधन
FAM/HEX/CY5 और अन्य मल्टी-चैनल फ्लोरोसेंट पीसीआर उपकरण के साथ।
नमूना आवश्यकताएँ
1. लागू नमूना प्रकार: गले के स्वैब, नासॉफिरिन्जियल स्वैब, ब्रोन्कोएल्वियोलर लैवेज द्रव, थूक।
2.नमूना संग्रह (एसेप्टिक तकनीक)
ग्रसनी स्वाब: टॉन्सिल और पिछली ग्रसनी दीवार को एक ही समय में दो स्वाबों से पोंछें, फिर स्वाब सिर को नमूना समाधान वाले टेस्ट ट्यूब में डुबो दें
थूक: रोगी को गहरी खांसी होने के बाद, खांसी वाले बलगम को एक स्क्रू कैप टेस्ट ट्यूब में नमूना समाधान के साथ इकट्ठा करें;ब्रोन्कोएल्वियोलर लैवेज द्रव：चिकित्सा पेशेवरों द्वारा नमूनाकरण।3. नमूनों का भंडारण और परिवहन
वायरस अलगाव और आरएनए परीक्षण के नमूनों का परीक्षण यथाशीघ्र किया जाना चाहिए।जिन नमूनों का 24 घंटों के भीतर पता लगाया जा सकता है, उन्हें 4℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है;जिनका 24 के भीतर पता नहीं लगाया जा सकता
घंटों को -70℃ या उससे कम पर संग्रहित किया जाना चाहिए (यदि -70℃ की कोई भंडारण स्थिति नहीं है, तो उन्हें होना चाहिए)
अस्थायी रूप से -20℃ रेफ्रिजरेटर पर संग्रहीत)।परिवहन के दौरान नमूनों को बार-बार जमने और पिघलने से बचना चाहिए।नमूने एकत्र करने के बाद यथाशीघ्र प्रयोगशाला में भेजे जाने चाहिए।यदि नमूनों को लंबी दूरी तक ले जाने की आवश्यकता है, तो सूखी बर्फ भंडारण की सिफारिश की जाती है।
परीक्षण विधियाँ
1 नमूना प्रसंस्करण और आरएनए निष्कर्षण (नमूना प्रसंस्करण क्षेत्र)
आरएनए निष्कर्षण के लिए 200μl तरल नमूना लेने की सिफारिश की जाती है।संबंधित निष्कर्षण चरणों के लिए, वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट के निर्देश देखें।नकारात्मक और नकारात्मक दोनों
इस किट में नियंत्रण निष्कर्षण में शामिल थे।
2 पीसीआर अभिकर्मक तैयारी (अभिकर्मक तैयारी क्षेत्र)
2.1 किट से सभी घटकों को निकालें और कमरे के तापमान पर पिघलाएँ और मिलाएँ।उपयोग से पहले कुछ सेकंड के लिए 8,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज;अभिकर्मकों की आवश्यक मात्रा की गणना करें, और प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार की जाती है जैसा कि निम्नलिखित तालिका में दिखाया गया है:
| अवयव | एन सर्विंग (25μl सिस्टम) |
| एनसीओवी प्राइमर टाकमैन प्रोबमिक्स्चर | 18 μl × एन |
| आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान | 2 μl × एन |
| *एन = परीक्षण किए गए नमूनों की संख्या + 1 (नकारात्मक नियंत्रण) + 1 (एनसीओवीसकारात्मक नियंत्रण) | |
2.2 घटकों को अच्छी तरह से मिलाने के बाद, ट्यूब की दीवार पर सभी तरल को ट्यूब के नीचे गिरने देने के लिए थोड़े समय के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर 20 μl प्रवर्धन प्रणाली को पीसीआर ट्यूब में डालें।
3 नमूनाकरण (नमूना तैयार करने का क्षेत्र)
निष्कर्षण के बाद 5μl नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण जोड़ें।परीक्षण किए जाने वाले नमूने का आरएनए पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में जोड़ा जाता है।
ट्यूब को कसकर बंद करें और इसे एम्प्लीफिकेशन डिटेक्शन क्षेत्र में स्थानांतरित करने से पहले कुछ सेकंड के लिए 8,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
4 पीसीआर प्रवर्धन (प्रवर्धित पहचान क्षेत्र)
4.1 प्रतिक्रिया ट्यूब को उपकरण के नमूना सेल में रखें, और पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें:
| अवस्था | चक्र संख्या | तापमान(डिग्री सेल्सियस) | समय | संग्रहसाइट |
| रिवर्सTRANSCRIPTION | 1 | 42 | दस मिनट | - |
| पूर्व विकृतीकरणn | 1 | 95 | 1 मिनट | - |
| चक्र | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | डेटा संग्रहण |
उपकरण पहचान चैनल चयन: प्रतिदीप्ति संकेत के लिए FAM、HEX、CY5 चैनल का चयन करें।संदर्भ फ्लोरोसेंट NONE के लिए, कृपया ROX न चुनें।
5 परिणाम विश्लेषण (कृपया सेटिंग के लिए प्रत्येक उपकरण के प्रयोगात्मक निर्देश देखें)
प्रतिक्रिया के बाद, परिणाम सहेजें.विश्लेषण के बाद, छवि के अनुसार बेसलाइन के शुरुआती मूल्य, अंतिम मूल्य और सीमा मूल्य को समायोजित करें (उपयोगकर्ता वास्तविक स्थिति के अनुसार समायोजित कर सकता है, शुरुआती मूल्य 3 ~ 15 पर सेट किया जा सकता है, अंतिम मूल्य को सेट किया जा सकता है 5~20, समायोजन) लघुगणक ग्राफ में विंडो की दहलीज पर, दहलीज रेखा लघुगणक चरण में है, और नकारात्मक नियंत्रण का प्रवर्धन वक्र एक सीधी रेखा या दहलीज रेखा के नीचे है)।
6 मात्रा नियंत्रण (परीक्षण में एक प्रक्रियात्मक नियंत्रण शामिल है) नकारात्मक नियंत्रण: FAM, HEX, CY5 डिटेक्शन चैनलों के लिए कोई स्पष्ट प्रवर्धन वक्र नहीं
COV सकारात्मक नियंत्रण: FAM और HEX डिटेक्शन चैनलों का स्पष्ट प्रवर्धन वक्र, Ct मान≤32, लेकिन CY5 चैनल का कोई प्रवर्धन वक्र नहीं;
उपरोक्त आवश्यकताओं को एक ही प्रयोग में एक साथ पूरा किया जाना चाहिए;अन्यथा, प्रयोग अमान्य है और इसे दोहराने की आवश्यकता है।
7 परिणामों का निर्धारण.
7.1 यदि परीक्षण नमूने के एफएएम और एचईएक्स चैनलों में कोई प्रवर्धन वक्र या सीटी मान> 40 नहीं है, और सीवाई5 चैनल में एक प्रवर्धन वक्र है, तो यह अनुमान लगाया जा सकता है कि 2019 में कोई नया कोरोनोवायरस (2019-एनसीओवी) नहीं है। नमूने में आरएनए;
.2 यदि परीक्षण नमूने में FAM और HEX चैनलों में स्पष्ट प्रवर्धन वक्र हैं, और Ct मान ≤40 है, तो यह अनुमान लगाया जा सकता है कि नमूना 2019 के नए कोरोनोवायरस (2019-nCoV) के लिए सकारात्मक है।
7.3 यदि परीक्षण नमूने में एफएएम या एचईएक्स के केवल एक चैनल में स्पष्ट प्रवर्धन वक्र है, और सीटी मान ≤40 है, और दूसरे चैनल में कोई प्रवर्धन वक्र नहीं है, तो परिणामों को फिर से परीक्षण करने की आवश्यकता है।यदि पुन: परीक्षण के परिणाम सुसंगत हैं, तो नमूने को नए के लिए सकारात्मक माना जा सकता है
कोरोनावायरस 2019 (2019-nCoV)।यदि पुनः परीक्षण का परिणाम नकारात्मक है, तो यह अनुमान लगाया जा सकता है कि नमूना 2019 के नए कोरोनोवायरस (2019-nCoV) के लिए नकारात्मक है।
सकारात्मक निर्णय मूल्य
आरओसी वक्र विधि का उपयोग किट के संदर्भ सीटी मान को निर्धारित करने के लिए किया जाता है और आंतरिक नियंत्रण संदर्भ मान 40 है।
परीक्षण परिणामों की व्याख्या
1. प्रत्येक प्रयोग का नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए।परीक्षण के परिणाम तभी निर्धारित किए जा सकते हैं जब नियंत्रण गुणवत्ता नियंत्रण आवश्यकताओं को पूरा करते हैं
2.जब FAM और HEX डिटेक्शन चैनल सकारात्मक होते हैं, तो सिस्टम प्रतिस्पर्धा के कारण CY5 चैनल (आंतरिक नियंत्रण चैनल) से परिणाम नकारात्मक हो सकता है।
3.जब आंतरिक नियंत्रण परिणाम नकारात्मक होता है, यदि टेस्ट ट्यूब के एफएएम और एचईएक्स डिटेक्शन चैनल भी नकारात्मक होते हैं, तो इसका मतलब है कि सिस्टम अक्षम है या ऑपरेशन गलत है, परीक्षण अमान्य है।इसलिए नमूनों की दोबारा जांच कराने की जरूरत है.
